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PCR quantitative en temps réel et PCR digitale

Environnement scientifique et technique de la formation

Institut de biologie intégrative de la cellule - UMR 9198

RESPONSABLE

Robert DEBUCHY

Directeur de recherche

UMR 9198

LIEU

ORSAY (91)

ORGANISATION

5 jours
De 4 à 10 stagiaires

COÛT PÉDAGOGIQUE

1850 Euros

A L'ISSUE DE LA FORMATION

Evaluation de la formation par les stagiaires
Envoi d'une attestation de formation

DATES DU STAGE

17139 : du lundi 19/06/2017 au vendredi 23/06/2017

17220 : du lundi 20/11/2017 au vendredi 24/11/2017

Janvier Février Mars Avril
Mai Juin
17139
Juillet Août
Sept. Oct. Nov.
17220
Déc.

OBJECTIFS

- Acquérir les connaissances théoriques et pratiques permettant de choisir la stratégie de PCR quantitative (temps réel ou digitale) la mieux adaptée aux contraintes expérimentales
- Avoir une vue d'ensemble des logiciels couramment utilisés pour l'analyse des résultats

PUBLIC

Chercheurs, ingénieurs et techniciens

PRÉREQUIS

Maîtriser les techniques de la biologie moléculaire

PROGRAMME

Cours et travaux dirigés (50 % du temps, les après-midis)
- Principes de la PCR, choix des amorces, résolution des problèmes de spécificité et de sensibilité
- Principes de la PCR quantitative en temps réel : notion de Cq, formats de fluorescence, méthodes de calcul de l'efficacité
- Principes de la PCR quantitative à standard externe (PCR quantitative absolue)
- Principes de la PCR relative, choix des gènes de normalisation avec les logiciels geNorm 1, NormFinder2 et BestKeeper3, normalisation par la méthode Δ Δ Ct et analyse statistique avec le logiciel REST4
- Principe de la PCR quantitative digitale : loi de Poisson
- Normes MIQE
Travaux pratiques (50 % du temps, les matins)
- Choix des amorces
- Détermination de l'efficacité des amorces : méthode des dilutions en série, méthode linRegPCR5
- Recherche de gènes de référence et analyse des résultats avec les logiciels geNorm1, NormFinder2 et BestKeeper3
- Quantification relative par la méthode Δ Δ Ct et analyse des résultats avec le logiciel REST4
- Quantification par utilisation d'un standard externe et validation du standard par PCR digitale
- Application de la PCR digitale pour la détermination de la taille d'un génome
Formats de détection utilisés : SYBR Green, sondes à hydrolyse, Molecular Beacon, sondes dual hybridization (sondes Light Cycler), duplex
1 : J Vandesompele et al., 2002, Genome Biol., 3 (7), 1-12, 2 : CL Andersen et al., 2004, Cancer Res., 64, 5245-5250, 3 : MW Pfaffl et al., 2004, Biotechnol Lett., 26, 509-515, 4 : MW Pfaffl et al., 2002, Nucleic Acids Res., 30, 9e36, 1-10, 5 : C Ramakers et al., 2003, Neuroscience Letters 339, 62-66.

EQUIPEMENT

LightCycler (Roche Diagnostics), CFX96 (Bio Rad), QX200 (Bio Rad)

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