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PCR quantitative en temps réel et PCR digitale

Environnement scientifique et technique de la formation

Institut de biologie intégrative de la cellule - UMR 9198

RESPONSABLE

Robert DEBUCHY

Directeur de recherche

UMR 9198

LIEU

ORSAY (91)

ORGANISATION

5 jours
De 4 à 10 stagiaires

COÛT PÉDAGOGIQUE

2000 Euros

A L'ISSUE DE LA FORMATION

Evaluation de la formation par les stagiaires
Envoi d'une attestation de formation

DATES DU STAGE

20217 : du lundi 29/06/2020 au vendredi 03/07/2020

20266 : du lundi 23/11/2020 au vendredi 27/11/2020

Janvier Février Mars Avril
Mai Juin
20217
Juillet Août
Sept. Oct. Nov.
20266
Déc.

OBJECTIFS

- Acquérir les connaissances théoriques et pratiques permettant de choisir la stratégie de PCR quantitative (temps réel ou digitale) la mieux adaptée aux contraintes expérimentales
- Avoir une vue d'ensemble des logiciels couramment utilisés pour l'analyse des résultats

PUBLIC

Chercheurs, ingénieurs et techniciens

PRÉREQUIS

Maîtriser les techniques de la biologie moléculaire

PROGRAMME

Cours et travaux dirigés (50 % du temps, les après-midis)
- Principes de la PCR, choix des amorces, résolution des problèmes de spécificité et de sensibilité
- Principes de la PCR quantitative en temps réel : notion de Cq, formats de fluorescence, méthodes de calcul de l'efficacité
- Principes de la PCR quantitative à standard externe (PCR quantitative absolue)
- Principes de la PCR relative, choix des gènes de normalisation avec les logiciels geNorm1, NormFinder2 et BestKeeper3, normalisation par la méthode Δ Δ Ct et analyse statistique avec le logiciel REST4
- Principe de la PCR digitale, appareils et applications
- Normes MIQE

Travaux pratiques (50 % du temps, les matins)
- Choix des amorces
- Détermination de l'efficacité des amorces : méthode des dilutions en série, méthode linRegPCR5
- Recherche de gènes de référence et analyse des résultats avec les logiciels geNorm1, NormFinder2 et BestKeeper3
- Quantification relative par la méthode Δ Δ Ct et analyse des résultats avec le logiciel REST4
- Quantification absolue par utilisation d'un standard externe
- Application de la PCR digitale pour la détermination de la taille d'un génome et CNV
Formats de détection utilisés : SYBR Green, sondes à hydrolyse, Molecular Beacon, sondes dual hybridization (sondes Light Cycler), duplex

1 : J Vandesompele et al., 2002, Genome Biol., 3 (7), 1-12, 2 : CL Andersen et al., 2004, Cancer Res., 64, 5245-5250, 3 : MW Pfaffl et al., 2004, Biotechnol Lett., 26, 509-515, 4 : MW Pfaffl et al., 2002, Nucleic Acids Res., 30, 9e36, 1-10, 5 : C Ramakers et al., 2003, Neuroscience Letters 339, 62-66.

EQUIPEMENT

LightCycler (Roche Diagnostics), CFX96 (Bio Rad), QX200 (Bio Rad)

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