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La PCR et la Covid-19

Qu'est-ce que la PCR ?

"La PCR est une méthode permettant de produire in vitro et rapidement […] un très grand nombre d’exemplaires d’une petite partie du génome d’un organisme."

La PCR est une méthode permettant de produire in vitro et rapidement (en 45 à 90 mn) un très grand nombre d’exemplaires d’une petite partie du génome d’un organisme. Ces milliards de copies identiques peuvent être utilisées pour de nombreuses applications (détection, génotypage, clonage, séquençage, quantification) qui seraient impossibles avec les quelques matrices initialement présentes dans le milieu réactionnel.

La PCR correspond à une succession de cycles de réplication (entre 25 et 40) spécifiques d’une molécule d’ADN matrice. Elle utilise une ADN polymérase et des petits morceaux d’ADN simple brin (les amorces) qui bornent la séquence à amplifier. La détermination de ces amorces est une étape importante car elle a un impact direct sur la spécificité et la sensibilité de la PCR. Il existe deux grands types de PCR. D’une part, la technique dite « en point final », dans laquelle le manipulateur analyse le fragment amplifié à la fin des 25 à 40 cycles. Cette méthode ne peut pas être utilisée pour faire de la quantification, la quantité de produit final n’étant pas proportionnelle à la quantité de matrice initiale.Le deuxième groupe de techniques dites « quantitatives » permet de déterminer la quantité de matrice initiale. La technique quantitative la plus répandue, appelée PCR en temps réel, utilise des molécules fluorescentes pour suivre à chaque cycle la quantité de produit formé. Le traitement de ces données permet alors de comparer l’expression d’un gène entre deux ou plusieurs conditions (PCR quantitative relative), ou de déterminer la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon (PCR quantitative avec une droite étalon). Une nouvelle technique de PCR quantitative s’est développée ces dernières années grâce aux progrès de la microfluidique: c’est la PCR digitale. La PCR quantitative doit suivre une méthodologie rigoureuse, définie dans un corpus de bonnes pratiques de laboratoire appelées MIQE.


Quelles sont les différences entre la PCR quantitative en temps réel et la PCR digitale ?

"La PCR digitale apparaît […] comme un complément indispensable de la PCR temps réel, et non plus comme un compétiteur."

Une réaction PCR quantitative en temps réel effectuée sur un échantillon contenant très peu de matrice donnera un résultat très imprécis, car les réplicats d’une mesure sur une faible quantité sont très variables. Si le volume de cette réaction est divisé en un grand nombre de réactions PCR, on observera des réactions négatives. En effet, certaines de ces réactions PCR ne contiendront pas de cible à amplifier, puisque la matrice est peu abondante. En comptant les réactions négatives et le nombre de PCR totales, on pourra calculer la concentration de la solution en appliquant la loi de Poisson. Les technologies de PCR digitale permettent de faire un nombre croissant de PCR dans des volumes de plus en plus petits. A partir du volume utilisé pour une réaction en PCR en temps réel, les machines de PCR digitales génèrent de 20 000 à 10 millions de réactions PCR, ce qui permet de faire de la quantification de solutions avec un faible nombre de matrices mais avec une très grande précision.

Lors de l’apparition des machines de PCR digitale en 2011, certains scientifiques prédisaient la disparition de la PCR quantitative en temps réel à court terme. On peut constater que ce n’est pas le cas, en raison de la difficulté de l’application de la PCR digitale pour la mesure de l’expression des gènes. Dans ce domaine, la PCR en temps réel reste encore incontournable. Le domaine d’application de la PCR digitale est la quantification absolue, par exemple pour déterminer un titre viral, la recherche d’allèles rares en cancérologie, et la mise en évidence de CNV (copy number variation). En définitive, la PCR digitale apparaît maintenant comme un complément indispensable de la PCR temps réel, et non plus comme un compétiteur.


Comment la PCR est-elle utilisée dans la détection du Covid-19 ?

"Actuellement, chaque test PCR de détection du covid19 comporte quatre réactions : deux recherchent chacune une partie différente du génome du covid19, ce qui permet de diminuer les faux négatifs et les faux positifs."

Une étape essentielle pour la détection du Covid19 a été le séquençage de son génome. Les scientifiques ont pu ainsi définir des amorces spécifiques permettant de le détecter. Pratiquement, la détection du covid19 commence par un prélèvement. Ce prélèvement contient des cellules humaines et éventuellement le virus, qui a un génome ARN. Les ARN du prélèvement sont donc purifiés puis transformés en ADN. Les réactions PCR se font à partir de cette étape.

Actuellement, chaque test PCR de détection du covid19 comporte quatre réactions : deux recherchent chacune une partie différente du génome du covid19, ce qui permet de diminuer les faux négatifs et les faux positifs. Les deux autres réactions PCR sont des contrôles qui garantissent que les réponses négatives ou positives à la détection du covid19 ne résultent pas d’une erreur du personnel de laboratoire ou du mauvais fonctionnement du thermocycleur. La PCR quantitative est utilisée quand il faut quantifier la charge virale, par exemple pour estimer la réponse aux traitements contre le covid19, ou encore pour suivre la quantité du virus dans les eaux des stations d’épuration afin d’anticiper l’évolution de l’épidémie ou estimer la fraction de la population qui est contaminée.

Une méthode de détection dite LAMP, et désignée dans les médias par « méthode de détection rapide », permet de s’affranchir des thermocycleurs et du personnel qualifié nécessaire à leur fonctionnement. Cette méthode est plus rapide que la PCR (30 mn) et est très spécifique. Le principe de cette méthode est de générer à partir du génome viral un fragment d’ADN qui va pouvoir s’amplifier à une température constante. Cette méthode est très prometteuse, mais actuellement elle est peu utilisée et les protocoles proposés pour le covid19 nécessiteront des mises au point et des validations avant d’être utilisés à grande échelle.


Quel est le seuil de détection des tests du Covid-19 ?

"Pour une PCR fonctionnant avec des réactifs de qualité, et des amorces et une sonde conçues suivant les règles de l’art, la limite de détection (LoD) du test […] résulte de considérations économiques ou médicales."

Toute méthode d’analyse génère du bruit de fond qui peut noyer le signal si celui-ci est faible. La PCR n’échappe pas à cette règle, mais il existe plusieurs méthodes pour savoir si le signal obtenu à la fin d’une PCR provient bien de la cible visée. Dans le domaine médical, la nécessité d’avoir une fiabilité maximum impose l’utilisation de sondes. La sonde est un petit morceau d’ADN lié à une molécule fluorescente. La partie ADN va reconnaitre spécifiquement la cible et ses copies provenant de l’amplification par les amorces ; la molécule fluorescente va émettre un signal uniquement lorsque la reconnaissance a lieu. Avec les sondes, la PCR donne couramment un signal sans ambiguïté même si l’échantillon analysé contient initialement une cible unique, par exemple un seul exemplaire du covid19.

Pour une PCR fonctionnant avec des réactifs de qualité, et des amorces et une sonde conçues suivant les règles de l’art, la limite de détection (LoD) du test n’est pas une contrainte liée à la performance de la PCR, mais résulte de considérations économiques ou médicales. En effet, plus la LoD est basse, plus il faut faire de tests pour être sûr de détecter la cible. Si on vise une limite de détection égale à 1 molécule dans le prélèvement à tester (LoD=1), la loi de Poisson indique que 37 % des PCR effectuées sur le prélèvement avec ce niveau de virémie sont négatives, pour des conditions optimales de PCR. En effet, la distribution de la cible est aléatoire, avec pour conséquence de nombreuses réactions PCR sans cible. Habituellement, on fixe la LoD comme la quantité minimale de cibles présentes dans le prélèvement pour que 95 % des PCRs effectuées sur un prélèvement identique soient positives. Ceci correspond à un LoD de 3 dans des conditions optimales de PCR.


Vous proposez la formation PCR quantitative en temps réel et PCR digitale avec CNRS Formation Entreprises, en quoi consiste-t-elle ?

"Pendant ces trois jours, les stagiaires réfléchissent sur la PCR quantitative relative (méthode ΔΔCq), la PCR quantitative absolue avec une droite étalon, et la PCR digitale."

Les principes et les méthodologies de ces deux approches sont analysées en détails. Cette formation est caractérisée par une partie pratique importante, basée sur des expériences publiées dans des revues à comité de lecture, ou en cours de publication. La partie pratique permet de concrétiser les approches méthodologiques, d’aborder des points de détails pratiques qui échappent dans une approche purement théorique et de valider sa gestuelle. De plus, elle fournit un temps de réflexion et de maturation entre l’exposé des principes, qui débute chaque TP, et l’analyse des résultats effectuées en fin de TP.

La formation commence le lundi par une journée de rappels sur la PCR, en insistant sur les liens avec la PCR quantitative, et se poursuit par un exposé sur la PCR quantitative et les formats de fluorescence. Les mardi, mercredi et jeudi matin sont consacrés aux TP, les réactions tournent sur les thermocycleurs durant l’heure du déjeuner, et les résultats sont analysés l’après-midi. Un débriefing est effectué avant de passer à l’étape suivante, afin de s’assurer que les principes utilisés ont été acquis.

Pendant ces trois jours, les stagiaires réfléchissent sur la PCR quantitative relative (méthode ΔΔCq), la PCR quantitative absolue avec une droite étalon, et la PCR digitale. Les formats de fluorescence les plus courants sont utilisés au cours du stage et pour faire de la quantification en duplex. Le vendredi matin, il y a de nouveau des cours sur différents aspects de la PCR en temps réel et sur la PCR digitale. Le bilan de stage du vendredi après-midi permet aux stagiaires d’avoir une vue d’ensemble des techniques disponibles et du plan expérimental de chacune. Tout au long du stage, l’accent est mis sur l’application des règles MIQE.


A qui est-elle destinée et utile ?

"[...] Même si les bases de mathématiques et de statistiques ne sont pas parfaitement maitrisées, cela n’empêchera pas le stagiaire de comprendre comment faire son plan expérimental en adéquation avec les recommandations MIQE et comment utiliser les logiciels d’analyse."

Cette formation est destinée aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et chefs de service qui veulent comprendre le principe des méthodologies et le fonctionnement des logiciels utilisés pour analyser les résultats.

La partie théorique fait appel à la connaissance des opérations sur les logarithmes et sur les exponentielles pour démontrer chaque formule utilisée en PCR quantitative. L’utilité de ces démonstrations est de comprendre les modèles mathématiques permettant l’analyse des résultats, et surtout les conditions d’expérience imposées par ces modèles mathématiques. Les notions de base en statistique permettent d’interpréter les résultats. Mais même si les bases de mathématiques et de statistiques ne sont pas parfaitement maitrisées, cela n’empêchera pas le stagiaire de comprendre comment faire son plan expérimental en adéquation avec les recommandations MIQE et comment utiliser les logiciels d’analyse.

Co-auteurs : Robert DEBUCHY, directeur de recherche au CNRS, laboratoire I2BC, Eric ESPAGNE, maître de conférence, Université Paris-Saclay et Karine BUDIN, ingénieure de recherche, Université Paris-Saclay.